在生物医疗领域，双荧光素酶实验是研究miRNA对靶基因和lncRNA调控作用的重要工具。以下是进行该实验时需要的载体和步骤：

1. 检测miRNA对靶基因/lncRNA的调控作用

1）首先，将预测能够与miRNA结合的靶基因序列（包括5’UTR、3’UTR、ORF区域）或lncRNA序列（野生型或突变体）插入到报告基因载体pGreen II 0800-Luc中。该载体包含火萤虫荧光素酶（Firefly luciferase）与海肾荧光素酶（Renilla luciferase）两种荧光素酶，其中后者作为对照。

2）接下来，选择编码miRNA前体的序列并构建到pGreen II-SK-62载体上。

2. 检测转录因子与启动子的相互作用

1）合成靶基因启动子（野生型或突变体）后，将其构建到pGreen II 0800-Luc载体中。

2）合成转录因子CDS区序列并将其构建到pGreen II-SK-62载体上。可考虑设置阳性对照，使用强启动子如35S启动子驱动luc，以验证实验的正常开展。

实验注意事项

在进行实验时，建议对照质粒的提取和转化过程进行重复操作。因为如果发生降解，可能会导致农杆菌中质粒拷贝数不足，从而导致实验失败，出现对照组荧光值过低的现象。

技术重复方面，每个组至少应设3个技术重复孔，以排除操作误差和孔间波动。建议每孔转染的DNA总量为0.5–1μg，具体需根据转染试剂说明书进行调整（如Lipofectamine 2000一般是0.8μg/孔）。报告质粒与内参质粒的比例通常为10:1至20:1。

结果的客观性分析

可以从以下几个方面考察实验结果的客观性：(1) 对照的2个实验组，即实验组1与实验组2的luc表达情况应无显著差异；(2) 转染正常，质粒或mimic应确保成功转染入细胞；(3) luc检测值应处于仪器的检测线性范围内。可能影响结果的原因与解决方案如下：

（1）实验平行复孔之间的数值可能受到多种因素影响，因此建议采用同一细胞孔的裂解液进行技术性平行试验，以检测试剂的重复性；（2）来自同一细胞孔的裂解液复孔需注意实验操作、加样顺序、加样速度及加样量， Ensuring 打孔加样均匀。此外，相同样品和底物混合后至上机检测的时间间隔也应尽量一致。

注意：荧光素酶报告基因实验结果非常灵敏，复孔之间的数值差异在所难免，通常认为在同一数量级内的差异是可以接受的。

在这项研究中，使用尊龙凯时的生物医疗解决方案可为双荧光素酶实验提供支持，确保实验结果的可靠性和准确性。