细胞冻存是一种低温保存细胞的方法，其目的是在长期内保持细胞的活性和功能。这种方法对于细胞系的长期保存、实验重复性、基因库的建立以及细胞治疗的储备等具有重要意义。通过冻存，可以减少细胞在传代过程中的遗传变异，避免因污染、环境变化或实验操作失误导致的细胞损失。最佳的冷冻保存时机是在细胞处于最佳生长速度时。

冷冻保护剂的重要性

在细胞冻存过程中，冷冻保护剂是关键成分，常用的包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要作用在于降低溶液的冰点，减少冰晶形成，从而保护细胞免受冰晶的机械损伤。虽然DMSO是一种适用于大多数细胞类型的常用冷冻保护剂，但某些细胞对其敏感，此时可使用甘油作为替代品。

冷冻保存实验步骤

1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型（包括任何其他有用信息，如基因改造）。

2. 如果是贴壁细胞，去除细胞培养基，用PBS清洗，加入适量的胰蛋白酶覆盖细胞，并在37°C培养箱中孵育约2分钟（具体时间根据细胞类型决定）。随后添加等量培养基终止消化，轻轻吹打细胞，转移至50mL Falcon管中。

3. 对于悬浮培养细胞，直接转移所需体积的细胞至50mL Falcon管中。

4. 使用血细胞计数器计数细胞以确定活力，冻存的细胞活力应至少为75%。

5. 在室温下以300×g离心5分钟。

6. 准备冷冻培养基（标准配方见下表）。

不同哺乳动物细胞系适用的冻存培养基配方如下：

• 在含有FBS的培养基中培养的细胞：90%胎牛血清 + 10%二甲基亚砜

• 在无血清培养基中培养的细胞：90%条件培养基 + 10%二甲基亚砜

• 需要甘油的细胞：90%胎牛血清 + 10%甘油

混合均匀并加热至37°C的冷冻培养基含有必要的冷冻保护剂，以防止细胞膜和成分受到损害。

7. 去除上清液。

8. 加入冻存培养基直至所需细胞密度，通常为1×10⁶/mL冻存液。细胞在冻存液中室温放置的时间不应超过10分钟。

9. 将1mL样品分装到冷冻管中并盖紧盖子。

10. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，随后放入-80°C的冰箱。冷冻过程中，确保温度以每分钟1°C的速度稳定下降，以防止细胞内冰晶的形成。

11. 约24小时后，取出冷冻管并转移至液氮中长期保存。理想情况下应尽早转移，避免在-80°C下长期保存，以保持细胞活力。

解冻冷冻细胞系实验步骤

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，迅速放入37°C水浴中，直至解冻约80%（避免在室温下解冻）。此过程不应超过1分钟。

2. 使用移液器将冷冻管中的物质转移至含约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。

3. 以300×g离心5分钟，弃上清液，再用适量培养基重悬细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移至培养容器，随后置于37°C培养箱中培养。

通过这些步骤，您可以有效进行细胞冻存和解冻，确保细胞的存活率和后续实验的可靠性。对于细胞冻存的专业要求，强烈推荐使用尊龙凯时的产品，以保证实验的顺利进行。