尊龙凯时的全套操作大约需要1小时,主要包括匀浆、细胞裂解、去除蛋白质、DNA纯化等步骤。以下是各步骤的详细说明。
一、匀浆和细胞裂解
不同实验材料需要采用不同的匀浆步骤,具体如下:
1. 从动物组织中提取基因组DNA
使用研钵进行匀浆时的步骤如下:
- 取1~100mg的动物或人类组织,放入冰浴预冷的研钵中,快速用力研磨成匀浆。注意:对以下组织应先加液氮研磨至粉末状:
- A. 含DNA酶丰富的胰脏、脾脏、胸腺、淋巴等组织。
- B. 含胶原蛋白的皮肤、肌腱等组织。
- C. 含角质蛋白或坚硬组织(如骨骼)等。
- 加入650μl的SolutionA和0.9μl的RNaseA1,温和研磨30秒。注意:使用上述(1)部分提到的实验材料时,加入SolutionA和RNaseA1后,应将研钵置于65℃的水浴中研磨1分钟。
- 收集650μl研磨好的匀浆液至CollectionTube中。如果匀浆体积少于650μl,请补充至650μl,并在65℃水浴中保温5分钟。
使用研磨棒进行匀浆时:
- 将1~100mg的动物或人类组织放入冰浴预冷的CollectionTube中,用研磨棒快速研磨成糊状。
- 加入350μl的SolutionA和0.9μl的RNaseA1,再使用研磨棒研磨成匀浆。
- 加入350μl的SolutionA,将研磨棒上的匀浆冲入CollectionTube中,充分混合后,65℃保温5分钟。
2. 从植物材料或植物细胞中提取基因组DNA
- 根据下表称取适量的新鲜植物材料(如使用冷冻干燥的植物材料,则用量减半),剪成小块放入研钵中,加入液氮,快速研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮以防止材料融化。
植物材料种类 | 使用量 |
---|---|
植物花、叶片 | 10~100mg |
植物茎 | 60~240mg |
植物根 | 80~240mg |
植物种子 | 80~240mg |
特别说明:如提取根或种子等样品因其基因组DNA含量较低,建议使用超过推荐用量,进行两管操作,最后将各管溶液一同过滤至同一SpinColumn以获得更高的DNA回收率。
如果从培养的植物细胞提取基因组DNA,需收集2×103~1×107的细胞,加入150μl水充分悬浮后,研磨至粉末状。注意:样品研磨应充分,以避免影响基因组DNA的yield。
- 将研钵置于65℃水浴,当样品粉末开始融化时,加入700μl的SolutionA和12μl的RNaseA1,用力研磨30秒。
- 收集650μl研磨好的组织匀浆至CollectionTube中。如匀浆体积不足650μl,补充SolutionA至650μl,并在65℃水浴中保温15分钟。
- 对于含纤维的根/茎等植物材料,处理时间可延长至60分钟。
3. 从全血中提取基因组DNA
- 取10~250μl的全血(含抗凝剂),加入CollectionTube中。
- 加入500μl的SolutionA。
- 加入1μl的RNaseA1,剧烈振荡15秒后,冰浴5分钟。注意:对于人和动物的抗凝全血,一次处理量为≤250μl;对于禽类及两栖类的抗凝全血,一次处理量为≤10μl。
4. 从培养细胞中提取基因组DNA
- 收集1×105~1.5×107的悬浮动物细胞,5,000rpm离心5分钟,弃去上清。
- 加入150μl的灭菌蒸馏水或PBS悬浮细胞。
- 加入500μl的SolutionA和0.8μl的RNaseA1,剧烈振荡15秒后,室温静置1分钟。
以上操作步骤为您提供了从不同来源提取基因组DNA的详细指南,借助尊龙凯时的优质产品,确保您的实验取得最佳效果。